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土壤离心机提取土壤DNA的方法

2015/3/11 12:50:32??????点击:

1.称取样品土样5g,加入灭菌的石英砂,不要液氮研磨,这样子对DNA伤害很大,几乎全部片段化了。可以在这步加上PBS洗涤下土壤,一是能够去除些杂质,二是能够使得土壤处于悬浮状态,然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2-3min,使得土壤颗粒破碎。然后用土壤离心机12000rpm离心5min,弃上清。

      2.加入13.5mL的DNA提取Buffer,100微升20mg/mL蛋白酶K,37℃225rpm摇2h;

      3.加入700微升20%SDS,65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次;

      4.6000rpm室温离心15min,收集合间液相层;向沉淀中加入3mLDNA提取液,300微升20%SDS,65℃水浴30min,同上离心,收集合间液相层,合并;重复一次;这里可以考虑再增补抽提一次。或者用5mL而不是3mL。最后实在装不下了可以分在两个50mL离心管里面离心。

      5.向收集的液相层中加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次,8000rpm离心10min,收集上部液相层;在做抽提的时候加用一步酚氯仿,原因是酚能够更好的使蛋白变性。如果不考虑用酚的话,创议用氯仿异戊醇抽提两次。会发现颜色会变清不少。

      6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠,0.6倍体积的异丙醇,室温放置1-2h;

      7.沉淀物12000rpm离心15min,弃上清;向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤,12000rpm离心5min,弃上清;12000rpm离心30sec,移液枪析出残留液体;

      8.室温自然干燥沉淀,干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。沉淀贴壁很紧,不要用小枪头吹吸搅动,可以将沉淀浸没后放置于4度过夜或数小时,沉淀就会蓬松。

   土样比较特殊,黑色,腐殖质等物质含量高,这个必须纯化,样品里面太多的多糖类物质和腐殖质,选择qiagen的40KB的胶回收试剂盒,嫌太贵的话可以考虑电洗脱。

   DNA提取液组成:100mM Tris,100mMEDTA,200mMNaCl,2%PVPP,3%CTAB,pH9.0
  
   以上为三次提取的详细过程及试剂用量。

注意事件,所有的枪尖,包括1mL的都要去尖后灭菌。每个步骤动作都要轻柔,这样DNA才会完整。

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