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台式离心机实行肾单层细胞培养的操纵过程

2015/7/8 10:36:38??????点击:
  组合培养的方法很多,大体分为悬浮培养和固定培养两类。悬浮培养是将切碎的组合块经过台式离心机实行离心分离,然后将经过台式离心机分离出来的分散的细胞放在适当的培养液中,让其浮游于液体小实行培养,然后接种病毒。
 
  另外还有固定培养法是使组合块经过台式离心机分散的细胞粘附与容器壁上实行培养,待细胞生长优良后接种病毒。病毒在组合培养细胞中繁殖的首要标志是细胞病变(坏死、崩解、脱落等),细胞融合或形成包涵体,对红细胞的吸附作用等。
 
  下面简单先容经过台式离心机实行“肾单层细胞培养”的一般操纵技艺。
 
  1.取肾:用无菌操纵取出断乳前后幼龄动物的肾脏置灭菌平皿中,剪去留的被膜和脂肪,并纵向切成两半,剪去肾的被膜和脂肪,并纵向切成两半,剪去肾盂及髓质局部,用含双抗(指青、链霉素,下同)的汉克氏液洗净,移置小烧杯中,剪成乳糜状,再用汉克氏液洗2—3次,至液体澄清无血细胞为止。
 
  2.消化;加入10倍的0.125%胰酶液实行消化。有热消化法(在37℃水浴中)和冷消化法(在4℃冰箱中)两种。消化的时间按照不同的组合细胞和所用胰酶的活性而定,直至聚成絮状的肾组合又分散开。取出倾去胰酶,用汉克氏液洗涤数次,然后加入少量乳汉液,用吸管实行吹打(即吸入和吹出)10-20次,使组合分散为细胞。将分散的细胞经2—3层消毒纱布过滤,取滤液置于台式离心机中以1500转/分离心十分钟,弃去上清液,加适昆乳汉液混匀,再次经过台式离心机离心,最后加入乳汉液使细胞悬浮其中,收集于灭菌三角瓶中。
 
  3.细胞计数和分装:取已制好的细胞悬浮液,用计数白细胞的方法计数,按照计数结果,用营养液(pH6.8—7.0)稀释为每毫升含50-60万细胞,分装于小扁瓶中(容量约50毫升的扁瓶加悬液约5毫升),也可分装在链霉素小瓶中。
 
  4.培养:在37℃培养,3—4天即可粘附瓶壁形成单层细胞,以后每过3—4大更换一次维持液。
 
  5.接毒;将病料剪碎,按1:4加含双抗的汉克氏液研磨成乳糜状,经冻融处置使细胞破碎,病毒充分释放,用台式离心机,将转速控制在3000转/分左右离心15分钟,将上清液接种到已生长单层细胞的培养瓶中,在37℃温箱中吸附30-60分钟,然后加入维持液继续培养。
 
  6.收获病毒:每日或隔日用低倍显微镜观察细胞病变情况,当有50-75%细胞出现病变队时可收集培养瓶中液体,从放在冰箱(-20℃)中保存,此即繁殖的病毒液。
 
  7.注意事件:培养皿及其他使用器具的洁净、台式离心机的使用、水的质量、酸碱度、无菌操纵等,都是关系到组合培培养败的重要问题,必须严刻限定的请求去做。
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